סינון זרימה טנגנציאלית TFF בשילוב עם אולטרה צנטריפוגה להכנה יעילה של שלפוחית חוץ תאית קטנה
Aug 28, 2026| שלפוחיות חוץ תאיות קטנות (sEVs) הן שלפוחיות ננומטריות המופרשות על ידי תאים המכילים חומצות גרעין, חלבונים, מולקולות קטנות ורכיבים אחרים, וממלאות תפקיד חשוב בתקשורת בין תאית. שלפוחיות קטנות חוץ-תאיות מסוג-אקסוזום חולקות קווי דמיון גבוהים עם תאי האב שלהן. בהשוואה לננו-חלקיקים מלאכותיים, הם מציגים שיעורי פינוי חיסוני נמוכים יותר וציטוטוקסיות נמוכה יותר, מה שהופך אותם למועמדים מבטיחים כחדשיםכלי רכב להעברת תרופות in vivo. כמעט כל סוגי התאים יכולים להפריש את השלפוחיות הללו, והמחקר על יישומם כנשאי תרופות עובר בהדרגה מהמעבדה אל עבר יישומים קליניים. אוּלָם,ייצור-בקנה מידה גדול נותר צוואר בקבוק מרכזי.
שיטות נוכחיות לבידוד שלפוחית חוץ תאית
שיטות בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות נוכחיות כוללותאולטרה צנטריפוגה, צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, כרומטוגרפיה של-אי הכללה בגודל (SEC) ומשקעים של פוליאתילן גליקול (PEG).
משקעי PEG מציעים תשואה גבוהה ותפעול פשוט, אבל זה קשור לזיהום משמעותי על ידי חלבונים לא רצויים. צנטריפוגה של שיפוע צפיפות וכרומטוגרפיה של אי הכללה בגודל-יכולות לספק מוצרים ברמת טוהר- גבוהה, אבל היעילות שלהם נמוכה יחסית והתהליכים גוזלים זמן-. אולטרה צנטריפוגה נמצא בשימוש נרחב, אך נפח העיבוד שלה מוגבל על ידי קיבולת הצנטריפוגות, מה שמקשה על הגדלה.
יישום של סינון זרימה טנגנטיאלית עבור הפרדת sEV
סינון זרימה טנגנטיאלית (TFF) כבר הוחל על הפרדה של ננו-חלקיקים כגון ליפוזומים ווקטורים לנטי-ויראליים. ב-TFF, ההזנה זורמת באופן משיק על פני הממברנה, מה שעוזר להפחית את התכלות הממברנה ומקל על הגדלה של התהליך.
מאז שלפוחיות תאיות קטנות בדרך כלל נע בין30-200 ננומטרבקוטר, אקלטת ממברנה 0.45 מיקרומטרניתן לבחור במערכת TFF כדי להסיר חלבונים ושלפוחיות גדולות יותר, בעוד אקלטת ממברנה של 300 kDaניתן להשתמש כדי להסיר חלבונים בעלי משקל מולקולרי קטן- ולרכז את השלפוחיות החוץ-תאיות הקטנות הקיימות במצע התרבות.
אפיון חומר הגלם לאחר הפרדת TFF
ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) הראה כי קוטרי החלקיקים הופצו בעיקר בטווח של0-250 ננומטר.
עם זאת, מיקרוסקופ אלקטרונים העברה (TEM) חשפה כמות גדולה של חלבון מזהם, בעוד שלא נצפו שלפוחיות תאיות. תוצאות אלו הצביעו על כך שנדרש שלב טיהור נוסף במורד הזרם כדי לטהר עוד יותר את השלפוחיות החוץ-תאיות.
אפיון של תרכיז TFF לאחר 100 kDa Ultrafiltration
תרכיז TFF עבר עיבוד נוסף באמצעות אצינור אולטרה סינון 100 kDa.
נ.ת.ע הראתה כי קוטרי החלקיקים בתרכיזים שהתקבלו לאחר סבב אחד ושני של סינון אולטרה נותרו בעיקר בטווח של0-250 ננומטר. עם זאת, ביצוע אולטרה סינון פעמיים הביא להפחתה משמעותית במספר החלקיקים שהתקבלו.
ניתוח TEM הראה שלא נצפו-מבנים דמויי שלפוחית בתרכיזי אולטרה-סינון-פעמיים או פעמיים-, בעוד שנותרה כמות ניכרת של חלבון מזהם.
לָכֵן,סינון אולטרה של 100 kDa לא יכול לשמש ביעילות לטיהור מדיום התרבות לאחר ריכוז TFF.
אפיון של תרכיז TFF מטוהר על ידי Ultracentrifugation
NTA הראתה כי קוטרי החלקיקים של המוצרים המטוהרים הופצו בעיקר בטווח של0-250 ננומטר.
חשוב לציין, TEM חשף בבירור מבנים דמויי שלפוחית- בשדות ראייה שונים. תוצאות אלו הוכיחו כי לאחר ריכוז מצע התרבות באמצעות TFF,לאחר מכן ניתן להשתמש באולטרה-צנטריפוגה להפרדה וטיהור נוספת של שלפוחיות חוץ-תאיות.
אפיון של sEVs מבודדים מתאי גזע Mesenchymal מותנה בינוני באמצעות TFF בשילוב עם Ultracentrifugation
NTA הראתה כי קוטרי החלקיקים של המוצרים המטוהרים הופצו בעיקר בטווח של0-250 ננומטר.
מבנים דמויי שלפוחית- נצפו על ידי TEM. אנליזת הכתם המערבי הדגימה ביטוי חיובי של החלבונים הקשורים לשלפוחית החוץ-תאית-CD9, CD63 ו-ALIXבשלפוחיות החוץ-תאיות המטוהרות.
תוצאות אלו אישרו שהשלפוחיות החוץ-תאיות הקטנות המטוהרות הכילו אקסוזומים, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בשיטה זו גם עבורבידוד ומיצוי אקסוזומים.
מסקנה: TFF בשילוב עם Ultracentrifugation להכנת sEV באיכות גבוהה-
המחקר הוכיח זאתריכוז TFF לבדהביא למוצר המכיל כמות ניכרת של חלבונים מזהמים ולכן לא היה מספיק להשגת שלפוחיות תאיות מוסמכות.
כמו כן, באמצעות אצינור אולטרה סינון 100 kDa לטיהור משנילא הניב ביעילות מבני שלפוחית שלמים.
על ידי שילוב של ריכוז TFF עם טיהור אולטרה צנטריפוגה לאחר מכן, ניתן לשלב את היתרונות של שתי הטכניקות להשגתמוצרים-שלפוחיות קטנות חוץ-תאיות באיכות גבוהה.
בהשוואה לאולטרה צנטריפוגה קונבנציונלית בלבד, התהליך המשולב יכול ביעילותלהפחית את זמן העיבוד הכולל ולשפר את יעילות ההפרדה.
בתהליך העבודה הזה,TFF מאפשר העשרה מהירה של-דגימות בנפח גדול, התייחסות למגבלה של אולטרה צנטריפוגה קונבנציונלית בעיבוד נפחי דגימות גדולים. לאחר מכן אולטרה-צנטריפוגה מבצעת טיהור עמוק כדי להסיר זיהומי חלבון מרוכזים- יחד תוך שמירה על הטוהר ושלמות השלפוחיות.
יתר על כן, התהליך אינו דורש תוספת שלריאגנטים משקעים כימיים אקסוגניים, עוזר לשמר את הפעילות הביולוגית של השלפוחיות במידה המרבית האפשרית.
מנקודת המבט של תרגום תעשייתי, לתהליך זה יש משמעותלהגדיל- את הפוטנציאלועשוי לעזור להתמודד עם האתגרים הקשורים לייצור-בקנה מידה גדול של שלפוחיות חוץ-תאיות עבוראספקת תרופות, רפואה רגנרטיבית ופיתוח מוצרים נלווים. הוא גם מספק בסיס ניסיוני מוצק לאופטימיזציה של תהליכים שלאחר מכן וייצור בקנה מידה פיילוט-.
הַפנָיָה
Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.הקמת שיטה להפרדה של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות על ידי סינון זרימה טנגנטיאלית בשילוב אולטרה-צנטריפוגה. כתב העת הסיני לביולוגיות, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.