פריצת דרך מדעית|תהליך הפרדה וטיהור לקולגן מסוג II רקומביננטי
Aug 20, 2026| קולגן מסוג II הוא חלבון מבני שנמצא בעיקר ברקמת סחוס. הוא מספק תמיכה וריפוד למפרקים ומסייע בשמירה על התכונות המכניות ושלמות המבנית של הסחוס. יש לו פוטנציאל יישום משמעותי בטיפול רפואי במפרקים ובהנדסת רקמות סחוס.
בהשוואה לשיטות מיצוי מסורתיות, קולגן רקומביננטי המיוצר באמצעות תסיסה מארח מיקרוביאלית מציע איכות יציבה, תאימות ביולוגית טובה וללא סיכון לזיהום ויראלי, מה שהופך אותו למוקד מחקר מרכזי. קולגן מואנש רקומביננטי מסוג II המיוצר על ידי תסיסה באמצעות *Pichia pastoris* מהונדס משך עניין מחקרי רב. עם זאת, העלות הגבוהה והמורכבות של ההפרדה והטיהור נותרו אתגרים גדולים בהקמת תהליך יעיל לייצור-תעשייתי בקנה מידה של קולגן רקומביננטי.
צוות מחקר מבית הספר למדעי החיים והנדסה רפואית באוניברסיטת Anhui, בשיתוף עם Anhui Zhongsheng Anlan Health Industry Co., Ltd., פיתח תהליך הפרדה וטיהור מלא עבור קולגן מסוג II הומני רקומביננטי -23k המבוסס על סינון זרימה טנגנטיאלית (TFF) בשילוב עם שינוי זרימה חלשה של DEAE{{}} ב-{4} , מתן פתרון אפשרי לייצור בקנה מידה גדול.
תהליך טיהור בקנה מידה תעשייתי-שלם
התהליך כולו מורכב מארבעה שלבים עיקריים:
סינון הבהרה ← ריכוז ודיאפילטרציה ← זרימת עמודות DEAE-דרך כרומטוגרפיה ← הקפאה-ייבוש
איור 1. תהליך הפרדה וטיהור עבור קולגן מסוג II-23k הומני רקומביננטי
סינון תהליך מפתח
צוות המחקר השווה ארבעה סוגים של אמצעי כרומטוגרפיה-לחילופי יונים: חילופי-אניונים חזקים, חילופי אניונים-חלשים DEAE, חילופי קטונים-חזקים SP ועמודות חילופי קטונים חלשים CM.
Among them, the DEAE weak anion-exchange column showed the best performance. Under a buffer condition of pH 7.0 , the column was operated in flow-through mode , achieving a target protein purity of >95% and a recovery rate of >90%, ללא שאריות פיגמנטים שזוהו.
תהליכי ההפרדה והטיהור של קולגנים רקומביננטיים שונים המתבטאים על ידי מארחים מיקרוביאליים שונים משתנים במידה ניכרת. באופן כללי, עם זאת, ניתן לחלק את האסטרטגיה הכוללת להפרדה ראשונית וטיהור עדין.
מטרת ההפרדה הראשונית היא להסיר חומר מרחף מוצק כמו תאים מיקרוביאליים ולהכין את מרק התסיסה לטיהור עדין שלאחר מכן. שלב זה כולל בעיקר צנטריפוגה וסינון. צנטריפוגות תעשייתיות קונבנציונליות הן בדרך כלל גדולות בגודלן, יקרות ומוגבלות במהירות הסיבוב, וכתוצאה מכך יעילות עיבוד נמוכה יחסית. לסינון זרימה טנגנטיאלית (TFF) יש עלות תפעול נמוכה יותר ומפחית ביעילות את סתימת הממברנה והתכלות הקשורים לסינון רגיל ללא מוצא-. לכן, TFF יושם באופן נרחב לסינון הבהרה וריכוז/דיאפילטרציה של מרק תסיסה המכילים חלבונים רקומביננטיים.
מטרת הטיהור העדין היא לשפר עוד יותר את טוהר המוצר על ידי הסרת זיהומים כגון חלבוני תא מארח ופיגמנטים באמצעות טכניקות כרומטוגרפיות. בין הטכנולוגיות הללו, כרומטוגרפיית חילופי יונים- מציעה רזולוציה גבוהה וסלקטיביות חזקה ונמצאת בשימוש נרחב לייצור-בקנה מידה גדול של ביומולקולות שונות.
בייצור תעשייתי, כרומטוגרפיית חילופי יונים- מציבה דרישות גבוהות יחסית לבירור המדגם וחוזק יוני. בינתיים, TFF יכול להתמודד עם כמויות גדולות של חומר הזנה, קל לתחזוקה ומציע מדרגיות טובה, מה שהופך אותו ליישום נרחב בתהליכי טיהור במורד הזרם של מוצרים ביולוגיים.
לכן, בעת הקמת תהליך ההפרדה והטיהור עבור II-23k, נעשה שימוש בממברנת סיבים חלולים של 0.22 מיקרומטר TFF לסינון הבהרה של מרק התסיסה כדי להסיר תאים מיקרוביאליים וזיהומים מוצקים אחרים. לאחר מכן נעשה שימוש בקלטת ממברנה שטוחה של 5 kDa TFF- לריכוז ולדיאפילטרציה, והשלימה את הטיפול המקדים לפני הכרומטוגרפיה. לבסוף, נעשה שימוש בכרומטוגרפיה של עמודת DEAE במצב זרימה לטיהור.
התוצאות הוכיחו שהתהליך בוצע ביעילות, והשיג טוהר המוצר הסופי של כ-95%, ללא פיגמנטים שאריות. שיעור ההחלמה הכולל של התהליך המלא הגיע לכמעט 60%.
שיפורים נוספים בהתאוששות עשויים להיות מושגים על ידי הגדלת נפח ההזנה והפחתת קריאת מד הלחץ של קלטת הממברנה במהלך שלב הריכוז והדיאפילטרציה. השחזור של שלב הכרומטוגרפיה יכול להשתפר על ידי הורדת טמפרטורת ההפעלה של הכרומטוגרפיה והגדלת ריכוז יוני המלח במאגר.
הַפנָיָה
Meng Zixuan, Shi Weiwei, Zhang Maifei, ועוד. תהליך הפרדה וטיהור עבור קולגן מסוג II הומני רקומביננטי. *כתב העת הסיני לביולוגיה*, 2026, 43(1): 91–96.